في المقابل، يُمكن تفضيل تاريخ C57BL/6 لأنه لا يُستخدم عادةً في سلالات البحث المُهجنة، ولأن منتجات تصميم CRISPR تُتلاعب بـ C57BL/6 كجينوم مصدر. تتوفر معظم بيانات التسلسل الجينومي لإنشاء الحمض النووي للمتبرع بفضل اتحاد تسلسل جينوم الفأر الجديد (MGSC). يجب فحص موقع كل عملية تثبيت مُستهدفة بعناية لتجنب أي مشاكل تنظيمية. حتى مع استخدام CRISPR، يصعب إنتاج إدخالات أعلى من 5 كيلو بايت في الفئران.
على سبيل المثال، لتوليد أليل ناقض مشروط، يعمل حمض نووي واحد من متبرع SS متعدد التكرارات يحتوي على إكسون/إكسونات مُفلَكة بشكل أكثر فعالية من استخدام عدد قليل من جزيئات sgRNAs لإدخال مواقع loxP في وقت واحد. ولكن على عكس المعايير الحقيقية للزيجوت الفأري، سيتم اختبار تمييز جزيئات sgRNAs في مزرعة الأنسجة في حال عدم توفر تحليل الكيسة الأريمية للفأر المتبرع (Went et al., 2013a). على سبيل المثال، يمكن استخدام خلايا Es (Wang et al., 2013; Yang et al., 2013) لتحديد فعالية تعديل الجينوم قبل الحقن، خاصةً وأن خلايا Es تتمتع بأعلى كفاءة في تعديل الجينوم مقارنةً بالخلايا الجسدية (Yu et al., 2015).
عوامل التاريخ
إلى جانب الأداء العام لـ sgRNA، هناك قلق آخر بشأن تعديل الجينوم، وهو احتمال حدوث طفرات بعيدة عن الهدف، خاصةً عند البحث عن نمط ظاهري جيد للفأر. تُقدم معظم تطبيقات بناء sgRNA في CRIPSR قائمة بالمواقع المحتملة للهدف، لذلك، عند الإمكان، يُلجأ إلى أسلوب قائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للكشف عن طفرات indel في هذه المواقع باستخدام اختبار عدم تطابق الإنزيم. يُستخدم التكاثر في فأر بري "نظيف" لفصل الطفرات غير المرغوب فيها (سيتم إجراء تهجينين على الأقل لتقليل الطفرات غير المستهدفة) (Raveux et al., 2017).
2 قم بالتثبيت ويمكنك إنشاء ركيزة خطية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل
قد يكون تعديل معاييرك الخاصة بالإباضة الفائقة وجمع الزيجوت ضروريًا عند استخدام سلالات إضافية (Qin et al., 2016). يمكن بدء إنتاج sgRNA وmRNA Cas9 في الزيجوت طريقة الدفع في كازينو entropay الفأري إما عن طريق الحقن السيتوبلازمي، أو عن طريق استخدام مُعالج دقيق قائم على البيزو، أو عن طريق الحقن النووي الأولي، والذي عادةً ما يكون باستخدام مُحقن دقيق (Yang et al., 2014). بشكل عام، لم تُلاحظ أي اختلافات ظاهرية في أيٍّ من النوعين من البداية (Horii et al., 2014).
لتعديل الجينوم داخل أنسجة الثدييات، تُلغي هذه الحذفات الجينومية نتيجةً لطفرة تغيير الهيكل. في المقابل، إذا توافر الحمض النووي للمتبرع، فسيتم معالجة DSB الجديد باستخدام HDR، حتى لو كان ذلك بكميات أقل من NHEJ. يُطوّر CRISPR-Cas9 لاحقًا للتحكم الجيني في الحيوانات الكاملة، على سبيل المثال، لتوليد الحذف الجيني وحذف الجينات في الفئران.
يمكن استخدام إعادة التركيب أيضًا في عمليات الحذف، والطفرات النقطية، والتضاعف، والانعكاسات، والاندماجات، والعلامات. يتم إنتاج ركيزة خطية من الحمض النووي (DNA) تحتوي على التغييرات أو التماثلات المطلوبة لتوجيه الحمض النووي إلى العضلة. لا يُعد Gam ضروريًا لإعادة التركيب، ولكنه يزيد من تردد إعادة تركيب الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) حتى 20 انحناء. Exo هو نوكلياز خارجي مزدوج السلسلة (DNA) بطول 5'→3'، وهو ضروري لإعادة تركيب الحمض النووي ثنائي السلسلة. يُعد بروتين بيتا الجديد، وهو بروتين تلدين جيد للحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)، الإنزيم الرئيسي لإعادة التركيب في عملية إعادة التركيب. والجدير بالذكر أن عناصر إعادة التركيب الآلية، مثل بروتين إعادة التركيب السري RecA، ليست ضرورية لإعادة التركيب.
فيما يتعلق بترتيب صفحات loxP، تُؤدي إعادة التركيب الجديدة إلى حذف أو عكس جينات العائلة المستهدفة. ونظرًا لطبيعة cre-loxP القابلة للتحريض، سيتم تحفيز عملية الحذف الجديدة بواسطة مركبات كيميائية، بما في ذلك التتراسيكلين والتاموكسيفان. يُحفز تكوين التتراسيكلين عملية نسخ cre recombinase الجديدة، بينما يُعد التاموكسيفان مسؤولًا عن النقل الذري. تُنتج البادئات المُحيطة منتجًا حيث تكون مواقع indel غير متماثلة في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد. بعد ذلك، يتم تقسيم هذه البادئات غير المتطابقة بواسطة مادة T7E1 الكيميائية (WT – النوع البري؛ HT – متغاير الزيجوت) لإنتاج شظايا مُختزلة على هلام أغاروز نشط.
بينما يُحرك أوليفاريس جذعه ليبدأ القتال الداخلي الجديد على يمين كاستيلو، تُشكّل لكمة كاستيلو العلوية اليمنى إطارًا يمنع أوليفاريس من الحصول على لكمة الخطاف السفلي. ونظرًا لبنيته الجسدية القوية، يُوجّه كاستيلو لكمة علوية لإفساح المجال له لإنهاء القتال الداخلي، مُعيدًا ضبطها إلى مسافة كبيرة. ولكن، عندما لم يتمكن أوليفاريس من خوض القتال الداخلي من أجل الوصول إلى قمة مستواه، تضاءلت قدرته على استخدام لكماته الخطافية اليسرى بشكل كبير.
إلى جانب أعلى حالات الحذف، ثبت أيضًا إمكانية استخدام تقنية كريسبر في عمليات إدخال جينومية كبيرة (تشانغ وآخرون، 2015). ويُقترح حقن جينات sgRNAs التوأمية كوسيلة لزيادة احتمالية استهداف الجين الجديد، خاصةً عند الحاجة إلى تعديل جين ثنائي الأليلات (تشو وآخرون، 2014). وقد ثبت عمومًا أن الطفرات غير المستهدفة تُعدل جينوم كريسبر في أنسجة المرض، ولكنها قد تكون نادرة في الزيجوت (فو وآخرون، 2013؛ يانغ وآخرون، 2013). ومع ذلك، لا تزال الطفرات غير المستهدفة تُمثل مشكلة عند دراسة الفئران المُعدّلة وراثيًا. يؤدي قطع واحد من Cas9n إلى انقسام خيط واحد فقط، والذي يُصلح بسهولة؛ وبالتالي، لإنشاء DSB حقيقي، يلزم وجود عدد قليل من sgRNAs. لقد حلت تقنية CRISPR-Cas9 إلى حد كبير محل التركيز الجيني في الخلايا الجذعية الجنينية كوسيلة لتحرير الجينوم في الفئران، وذلك لأنها توفر إطارًا أسهل وخروجًا أسرع ضروريًا للحصول على فئران التجارب.
- لأن مدينة دوران تركز رأسها على الجانب الأمامي من بالومينو، فإن بالومينو غير قادر على رمي رابط يمين إلى الرأس.
- يتم تدمير صفحات EcoRI من خلال إدخال الحمض النووي للمتبرع الخاص بك لاستيعاب النمط الجيني للفأر الذي تم إنشاؤه بواسطة CRISPR والذي لا يتم فيه قطع شريط KI PCR بسبب Re.
- على الرغم من أن عمليات الإدراج أو الحذف العالية قد لا تحتاج إلى اثنين من sgRNAs لتحديد حجم الحمض النووي الجينومي بالكامل سواء تم تغييره أو إزالته.
- تحاول تصميمات الفئران الشرطية تفضيل فحص المشكلة الفردية لأن كليهما يشير إلى التشابه في النمط الظاهري عندما يتم حذف الجينات المحددة.
- تم إدخال أجزاء بحجم 1 كيلوبايت باستخدام CRISPR، ولكن الأداء بعيدًا عن HDR ينخفض بشكل أساسي لأن حجم أبعاد الإدخال الأحدث يزيد عن طوله.
بالإضافة إلى سهولة استخدام Cas9 في نوكلياز الحمض النووي، أُعيد استخدام CRISPR أيضًا لدمج وظيفة مُحفّزة للحمض النووي الريبوزي (RNA) في تنظيم أحدث النشاط النسخي للجينات العائلية المستهدفة. يتم ذلك من خلال استخدام Cas9 مُعطّل (dCas9) مرتبط بمنشطات النسخ، ومثبطات النسخ، ومعدلات التخلق الجيني (Komor et al. 2017). كبديل، يتم أيضًا تنشيط الجين المستهدف باستخدام Cas9 غير النشط باستخدام sgRNAs ميتة مُعدّلة مُصنّعة من أبتامرات MS2 ذات الدبابيس الشعرية. تُختصر هذه sgRNAs الميتة لإيقاف نمو DSB، بينما توظف أبتامرات MS2 بروتينًا أساسيًا مُركّبًا يتكون من أحدث بروتين غلاف بكتيريا MS2 المرتبط بمنشط نسخي (Liao et al. 2017). وقد ثبت أن معالجة تنشيط الجينات تعني دفع الجينات المعترف بها للمساعدة في تحسين الأمراض بما في ذلك جميع أشكال مرض السكري، ومشاكل الكلى، وضمور العضلات.
تُقلّص إجراءات استهداف الجينات هذه، بالإضافة إلى التطوير النهائي لتقنية CRISPR-Cas9، مدة زراعة الفئران المُعدّة طبيعيًا من 8 إلى 10 أيام إلى 90 يومًا. مع ذلك، تُوفّر تقنية CRISPR-Cas9 استبدالًا واسعًا لـ ZFNs وTALENs من حيث البنية والتركيب (الشكل 1). تتطلب ZFNs وTALENs تجميع نطاقات ربط الحمض النووي متعدد الوحدات وفقًا للعنوان الجينومي الجديد. تعتمد تقنية CRISPR على تكوين أحدث بروتين نووي ريبوزي من إندونوكلياز الحمض النووي Cas9، وهو ما يُمكّن من توجيه الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DSB) الجينومي من خلال 20 زوجًا قاعديًا من السلسلة الفرعية المتطابقة.